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手把手教你近端肾小管上皮细胞原代分离

实验操作流程:


       1、取双肾,置于冷的PBS中;


       2、去除肾蒂和包膜,在体式显微镜下切除肾皮质;


       3、将肾皮质剪碎,移入EP管中,PBS洗3次;


       4、清洗完毕,沉淀用1g/LⅠ型胶原酶,37℃,30min消化;


       5、加入3倍体积的完全培养基终止消化;


       6、将细胞悬液过80目筛;


       7、收集悬液,200目筛、1000rpm.离心5min;


       8、沉淀用45%percoll分离液制备25ml悬液;


       9、悬液置于5ml 100%percoll上,14000rpm,4℃,离心25min.;


       10、分层,选择倒数第二层细胞悬液;



       11、得到近端肾小管上皮细胞,用DF12+10%FBS+双抗铺板


注意事项:


       鼠龄要选小一些的,我们一般选2周内的,这样细胞生长活性更好



Q:为什么我取得原代肿瘤组织,分离的却不是肿瘤细胞?


A:取材时,我们要熟悉所需组织的类型和部位特征,选择肿瘤细胞集?#23567;?#27963;力较好的部分。避免结缔等正常组织。


Q:若是细胞中混?#19978;?#32500;细胞,如何去除?


A:?#19978;?#32500;细胞的去除对于肿瘤细胞培养十分重要。由于?#19978;?#32500;细胞贴壁速度较肿瘤细胞快,可利用反复贴壁法使二者分离,进而达到清除?#19978;?#32500;细胞的目的。


Q:为什么离心后,没有细胞分离出来?


A:需要考虑消化酶的因素,由于肿瘤组织较致密,胰酶无法消化,一般选用胶原酶,如胶原酶Ⅳ。若是组织十分致密可以再结合机械法,如研磨或者搅拌加速细胞分散。如下表为二者的区别:



注:胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶,根据分离的组织类型需选择合?#23454;?#33014;原酶类型。



Q:消化时间如何确定?


A:具体的消化酶的量和消化时间?#31579;?#25454;组织类型和多少进?#26800;?#25972;。


Q:消化之前为什么用EDTA?


A:EDTA是一种非酶消化物,又称螯合剂,对一些组织,尤其是上皮组织分散效果好。与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物后,形成的机械力可使细胞分散。




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