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免疫荧光细胞化学染色方法

一、标本制作

   可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片,经?#23454;?#22266;定或不固定,作免疫荧光染色用。


二、荧光?#22266;?#26579;色方法

(一)直接法

1.染色 切片经固定后,滴加经稀释至染色效价如1:8或1:16的荧光?#22266;澹?#22914;兔抗人γ-球蛋白荧光?#22266;?#25110;兔抗人IgG或IgA荧光?#22266;?#31561;),在室温或37℃染色30min,切片置入能保持潮湿的染色盒内,防止干燥。

2.洗片  倾去存留的荧光?#22266;澹?#23558;切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗两次,搅拌,每次5min,再用蒸馏水洗1min,除去盐结晶。

3.用50%缓冲(0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0~9.5)甘?#22836;?#22266;、?#23548;?/span>

4.对照染色

①正常免荧光血清染色,如上法处理切片,结果应为阴性。②染色抑制试验(一步法)?#33322;?#33639;光?#22266;?#21644;未标记的?#22266;?#29699;蛋白或血清(相同)等量混合,如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光?#22266;?#34987;稀释所致,可用盐水代替未标记抗血清,染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。③类属抗原染色试验,前面已作叙述。

直接法比较简单,适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度?#32454;?#30340;蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光?#22266;?#21482;能检查一种相应的抗原,特异性高而敏感性?#31995;汀?/span>


(二)间接法

(1)切片固定后用毛细滴管吸取经?#23454;?#31232;释的免疫血清滴加在其上,置于染色盒中保持一定的湿度,37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次,10min,用吸水吸去或吹干余留的液体。

(2)再滴加间接荧光?#22266;澹?#22914;兔抗人γ-球蛋白荧光?#22266;?#31561;),同上步骤,染色30min,37℃,缓冲盐水洗两次10min,搅拌,缓冲甘?#22836;?#22266;,?#23548;臁?/span>

对照染色:①?#22266;?#23545;照:用正常兔血清或人血清代替免疫血清,再用上法进行染色,结果应为阴性。②抗原对照:即类属抗原染色,亦应为阴性。③阳性对照。

间接法中上述方法称双层法(Double Layer Method)。另一种称?#34892;?#27861;,即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应?#22266;?#32467;合,再用该抗原之荧光?#22266;?#37325;叠结合其上,而间接地显示出组织和细胞中?#22266;?#30340;存在,方法步骤如下:

①切片或涂片固定后,置于染色湿盒内。

②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃,30min。

③缓冲盐水洗2次,每次5min,吹干。

④滴加特异性荧光?#22266;?#20877;用切片于37℃,30min。

⑤如③水洗。

⑥缓冲甘?#22836;?#22266;,?#23548;臁?/span>

间接法只需制备一种荧光?#22266;?#21487;以检出多种抗原,敏感性?#32454;擼?#25805;作方法较易掌握,而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体(如麻疹)等的研究和检查,所以已被广泛应用于自身?#22266;?#21644;感染病人血清的试验。


(三)?#22266;?#27861;

1.材料

(1)免疫血清60℃灭活20min,用Kolmers 盐水作2倍稀释成1:2,1:4,1:8……。?#22266;?#29992;1:10稀释的新鲜豚鼠血清,抗?#22266;?#33639;光?#22266;?#31561;,按下述的?#22266;?#27861;染色。免疫血清?#22266;?#32467;合的效价,如为1:32则免疫血清应作1:8稀释。

(2)?#22266;?#29992;新鲜豚鼠血清一般作1:10稀释或按?#22266;?#32467;合反应试管法所测定的结果,按2单位的比例,用Kolmers盐水稀释备用。Kolmers盐水配法:即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲盐水中,溶解MgSO4的含量为0.01%浓度。

(3)抗?#22266;?#33639;光?#22266;澹?#22312;免疫血清效价为1:4,?#22266;?#20026;2单位的条件下,用?#22266;?#26579;色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光?#22266;?#30340;染色效价,然后按染色效价1:4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。


2.方法步骤

(1)涂片或切片固定。

(2)吸取经?#23454;?#31232;释之免疫血清及?#22266;?#20043;等量混合液(此时免疫血清及?#22266;?#21448;都稀释一倍)滴于切片上,37℃作用30min,置于保持一定湿度的染色盒内。

(3)用缓冲盐水洗2次,搅拌,每次5min,吸干标本周围水液。

(4)滴加经过?#23454;?#31232;释之抗?#22266;?#33639;光?#22266;?0min,37℃,水洗同(3)。

(5)蒸馏水洗1min,缓冲甘?#22836;?#22266;。


3.对照染色

(1)抗原对照。

(2)抗血清对照:用正常兔血清代替免疫血清。

(3)灭活?#22266;?#23545;照?#33322;固?#32463;56℃30min处理后,按?#22266;?#21516;样比例稀释,与免疫血清等量混合后,进行?#22266;?#27861;染色。

本法之荧光?#22266;?#19981;受免疫血清的动物种属的限制,因而一种荧光?#22266;?#21487;作更广泛的应用,敏感性亦较间接法高,效价低的免疫血清亦可应用,节 省免疫血清,尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度?#31995;?#30340;抗原物?#36866;?#29978;为理想。


(四)膜抗原荧光?#22266;?#26579;色法

本法应用直接法或间接法的原理和步骤,可对活细胞在试管内进行染色,常用于T和B细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原和受体等的检查和研究,阳性荧光主要在细胞膜?#31232;ACS即采用此法原理。


(五)双重染色法

在同一标本上有两个抗原需要同时显示(如A抗原和B抗原),A抗原的?#22266;?#29992;FITC标记,B抗原的?#22266;?#29992;罗达明标记,可采用以下染色方法:

1.一步法双染色  先将两种标记?#22266;?#25353;?#23454;?#27604;例混合(A+B),按直接法进行染色。

2.二步法双染色 先用RB200标记的B?#22266;?#26579;色,不必洗去,再用FITC标记的A?#22266;?#26579;色,按间接法进行。

结果:A抗原阳性荧光?#27663;致?#33394;,B抗原阳性?#27663;?#26708;红色荧光。


(六)荧光?#22266;?#20877;染色法

若切片或其他标本经?#25345;?#33639;光?#22266;?#26579;色后,未获得阳性结果,而又疑有另外的病原体存在时,可用相应的荧光?#22266;?#20877;染色。

有时存档蜡块不能再用以切片,也可用存档的HE染色标本,褪去盖片和颜色,再作免疫荧光或其它免疫细胞化学的染色。


三、荧光抗原染色法

  某些抗原可以用荧光素标记,制成荧光抗原,标记荧光素的方法与制备荧光?#22266;?#26041;法相同。用荧光抗原可以直接检查细胞或组织内的相应?#22266;澹?#29305;异性较好,敏感性较差。染色方法同荧光?#22266;?#26579;色的直接法。由于多数抗原难以提纯或?#21487;?#19981;昂贵,一般很少采用此法。

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