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手把手教你流式凋亡染色!

Annexin V & 7 氨基放线菌素(7-amino-actinomycin D, 7-AAD)或碘化丙啶(Propidium iodide, PI)双染法检测细胞凋亡原理。


正常细胞(活细胞)具有完好的细胞膜,此时细胞膜的组分之一——磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)位于细胞膜的内侧,当细胞发生凋亡时,细胞膜的结构发生改变,这使得原本在细胞膜内侧的PS外翻到细胞膜的表面,这种现象在凋亡的早期就会出现,因此就可以用与PS具有高亲和力、标记了荧光素的膜连蛋白V(Annexin V)来检测早期凋亡的细胞。


由于晚期凋亡和一些坏死的细胞?#37096;?#20197;与Annexin V结合,因此需要引入另一种指标来将早期凋亡的细胞与之区分,这种指标就是细胞膜的通透性。与正常细胞和早期凋亡细胞不同,晚期凋亡及坏死细胞的膜通透性会增加,因此,一些原本不能进入到正常细胞内的核酸染料(如7-AAD和PI)便有机会进入细胞内与DNA结合。


所以,通过Annexin V和7-AAD /PI双染的方法,就可以把早期凋亡的细胞与晚期凋亡加坏死的细胞区分开来。


Annexin V和7-AAD双标测凋亡流式染色实例


小鼠腹腔巨噬细胞(每样2-5×105个细胞)Annexin V和7-AAD双染实例(本实例中巨噬细胞凋亡是通过紫外线30分钟照射诱导的)


1. 标志物:


活细胞:Annexin V-7-AAD-;早期凋亡细胞:Annexin V+7-AAD-;晚期凋亡和坏死细胞:Annexin V+7-AAD+;某种特定坏死细胞:Annexin V-7-AAD+;


2. 流式细胞仪:BD FACSCalibur;


3. 流式抗体及用量:1×Binding Buffer(250ul/test,联科生物的5×Binding Buffer用ddH2O配制,货号:LK-AP101-100-BB);Annexin V-APC(1ul/test,货号:BMS306APC,eBioscience);7-AAD(5ul/test; 货号:559925,BD);


4. 染色条件:本实例用胰酶将细胞消化下来进行染色,并没有染细胞的表面分子,如需标记表面分子,切记勿用胰酶,请在染Annexin V和7-AAD之前先按常规染法标记表面分子,洗去多余抗体后即可用1×Binding Buffer重悬细胞,加入Annexin V和7-AAD,室温避光孵育15分钟即可。由于此法中细胞未固定,因此需在染色后尽快检测;


5. 分析软件:Cell Quest;


6. 圈门策略及染色:FSC/SSC圈门策略请视不同细胞而定;


7. 常见问题小贴士:

A. 由于细胞凋亡因细胞种类、细胞所在体内环境、体外给予的刺激、染色过程中的操作不同而迥异,因此Annexin V和7-AAD双染检测凋亡,需要按照各自具体情况进行多次实验,以掌握自己实验条件下细胞凋亡的套路。


B. Annexin V染色的常见特性如上图所示,即使未凋亡的细胞(Annexin V-7-AAD-细胞),经过染色后在流式图上的位置也会右移,小白曾经和多位做过凋亡的伙伴们交流过,这种现象是Annexin V染色特有的,请大?#20063;?#35201;奇怪。小白曾经试图通过洗去多余抗体来将活细胞群(Annexin V-7-AAD-细胞群)调整到我们通常认为的“阴性细胞”位置,但是从实例图中大家也能发现这种方法是行不通的。至于为什么洗去多余抗体不能解决“移位”问题,请恕小编才疏学?#24120;?#33267;今还不知道原因,只是建议大?#20063;?#35201;采用洗多余抗体的方法来调整细胞在图上出现的位置,相信大家也发现了洗过之后,各群细胞比例已经发生改变了。


C. 由于平时实验中的细胞来之不易,久而久之便养成了节约的好习惯,所以本实例中采用的细胞数量较少,如果小伙伴们采用的细胞数量可以土豪到106级别,可采用300ul-500ul体系,加2ul-5ul Annexin V和10ul 7-AAD,具体染色条件请自行采取滴度实验。


D. 使用Annexin V和PI试剂盒的童鞋染色?#37096;?#25353;照试剂盒?#24471;?#26469;操作。


E. 此法的上机检测过程没有特别之处,与一般分子的上机检测类同,小伙伴们无需多虑。只是提醒一下使用PI的小伙伴们,PI的发射谱很宽,可以用第二或第三通?#35272;?#26816;测,大?#33008;?#36873;其一即可。另外,小伙伴们要特别注意在FSC/SSC圈门时,所选细胞范围会对结果造成?#27927;?#24433;响,大家自己分析的时候就会发现这一点,所以小伙伴们在分析的时候要把所有分析对象都圈进FSC/SSC的门内,这样才能?#20174;?#30495;实情况。


F. 本法的优点在于无需固定细胞、染色快速,但是缺点是当细胞膜破裂时Annexin V?#37096;?#19982;细胞结合,而且在一些自噬受损的细胞中,PS外翻可能受阻,所以此时Annexin V就不再适合用于早期凋亡检测了。

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